1 做熒光定量PCR之前，考慮到的是你能接觸到什么機(jī)型的PCR儀，不同的PCR儀兼容的耗材以及試劑不一樣的，如果你沒有別人帶，自己第一次做，一定要注意。
2 做熒光定量PCR最重要的莫過于，引物和模板的準(zhǔn)備。提取RNA之后一定要電泳檢測(cè)其降解狀態(tài)，如果發(fā)生了降解很容易導(dǎo)致結(jié)果偏差；引物設(shè)計(jì)的好壞直接關(guān)系著后續(xù)實(shí)驗(yàn)的成功，所以引物合成回來，可以做個(gè)普通的pcr，跑電泳驗(yàn)證其特異性。如果同時(shí)要檢測(cè)很多的基因，那么設(shè)計(jì)的時(shí)候，引物的Tm最好都相近在60度左右，擴(kuò)增產(chǎn)物150bp左右最好，有利于操作。
3 熒光定量PCR的體系確定，大的體系容錯(cuò)率可能稍微高一點(diǎn)，小的體系對(duì)操作的精度和準(zhǔn)度要求比較高，但是可以很好的的節(jié)省cDNA模板。如果沒有電動(dòng)的分液槍，要熟練的使用普通移液器。
4 進(jìn)行具體實(shí)驗(yàn)之前，要測(cè)定引物的擴(kuò)增效率，通常來說，比較兩種處理中基因表達(dá)的差異是需要內(nèi)參基因的，這樣的比較，是假定興趣基因引物以及內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率相同且為1的。如果引物太多，可以看熒光定量PCR的擴(kuò)增曲線，如果形態(tài)相近的話，一般也認(rèn)為擴(kuò)增效率是一致的。
5 熒光定量PCR最少設(shè)置三個(gè)技術(shù)性重復(fù)組，同時(shí)一定要有空白對(duì)照組，有很多人沒有這種習(xí)慣，其實(shí)很危險(xiǎn)。
6 熒光定量PCR的程序和普通PCR不同，會(huì)多一個(gè)melting的部分，同時(shí)三步循環(huán)中延伸的部分可以去掉，節(jié)省時(shí)間。
7 熒光定量PCR結(jié)束之后要去看下溶解度曲線，每種擴(kuò)增產(chǎn)物的曲線為單峰既Ok
8 數(shù)據(jù)的處理，這部分首先要根據(jù)sd值判斷數(shù)據(jù)質(zhì)量。如果重復(fù)組數(shù)據(jù)波動(dòng)很大，則會(huì)導(dǎo)致結(jié)果不可信，當(dāng)然如果設(shè)置的重復(fù)組較多，有些明顯的單個(gè)異常值可以去掉，優(yōu)化數(shù)據(jù)。最后需要根據(jù)不同的目的來對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行不同的計(jì)算處理。
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