BCIP即5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸鹽(5-bromo-4-chloro-3-inodlylphosphate)。
NBT即四唑淡藍(lán)(Nitro-Blue-Tetrazolium)，為深藍(lán)色無定形微溶物質(zhì)。
當(dāng)二者存在時，在堿性磷酸酶作用下，NTB被還原形成不溶性的藍(lán)色(在硝酸纖維素膜上)
或紫色(在尼龍膜上)沉淀，據(jù)此顏色反應(yīng)來鑒定堿性磷酸酶。
產(chǎn)品特點(diǎn):
1．即開即用，省去自配溶液的麻煩。
2．條件經(jīng)過優(yōu)化，最低可以檢測到0.5fmol的靶分子(在硝酸纖維素膜上)，并且背景低
不需要自己摸索。
3．與硝酸纖維素膜和尼龍膜兼容，也可用于瓊脂糖凝膠原位雜交。
4．肉眼觀察實驗結(jié)果，直觀簡單，不需要額外的試劑和儀器。
| 成分 |
規(guī)格 |
| 25×BCIP |
1ml |
| 25×NBT |
1ml |
| AP緩沖液，10× |
50ml |
| 說明書 |
1份 |
本產(chǎn)品可以配制100mL BCIP/NBT 顯色液，具體使用次數(shù)與膜的大小密切相關(guān)。
使用方法:
一、配制溶液:
1．按每cm2 印跡膜需要0.1mL BCIP/NBT 顯色液的比例計算所需顯色液的用量，并按下表的配方配制的所需量
的BCIP/NBT 顯色液待用。
說明：下表以10mL 為例，用戶需要根據(jù)計算得到的所需顯色液體積按比例增減各成分用量。
| 成分 |
用量 |
| 超純水 |
9ml |
| AP緩沖液，10× |
1ml |
| BCIP溶液 |
50μl |
| NBT溶液 |
50μl |
注意：此溶液必須在1小時內(nèi)使用。
2．用10×AP緩沖液配制跟NBT-BCIP顯色液等體積的1×AP緩沖液待用。
二、顯色:
3．同鈍頭鑷子將印跡膜浸入到新鮮配制的1×AP緩沖液中，脫色搖床上搖晃5分鐘。
本方法也可以用于瓊脂糖凝膠原位雜交，處理方法一樣，
只是把經(jīng)過AP標(biāo)記探針或抗體雜交的印跡膜改成經(jīng)過AP 標(biāo)記探針或抗體雜交的凝膠。
4．同鈍頭鑷子將印跡膜浸入到新鮮配制的BCIP/NBT 顯色液中
(每cm2 印跡膜需要0.1mL BCIP/NBT 顯色液)，室溫避光靜置顯色直到看見所需條帶。
在硝酸纖維素膜上，條帶將呈現(xiàn)藍(lán)色；在尼龍膜上，條帶將呈現(xiàn)紫棕色。
注意：顯色過程中不要搖晃，否則有色沉淀物不容易聚集。
高豐度的靶分子可能只需5-30分鐘顯色，低豐度的靶分子可能需要24小時顯色。
顯色反應(yīng)一般會在24小時結(jié)束，所以顯色時間沒有必要超過24小時。
37℃放置可加速顯色反應(yīng)，縮短顯色時間。
5．顯色結(jié)束后，將印跡膜轉(zhuǎn)移到盛有超純水的托盤中搖晃以終止顯色反應(yīng)。
數(shù)分鐘后需要換水，共三次。
6．用吸水紙吸干膜上的水分，照相或掃描處理后避光干燥保存印跡膜。
對硝酸纖維素膜，如果用二甲苯將膜浸濕，則條帶會增強(qiáng)約5倍(膜變得透明，
使背景變低，條帶更明顯所致)。
7．如果不避光保存條，印跡膜上的條帶會逐漸褪色。硝酸纖維素膜上的顏色
不能脫去，如果想脫去尼龍膜上條帶的顏色，可以將膜浸入到裝在玻璃容器
的DMF溶液中，再進(jìn)行熱水浴直到顏 色脫去(需要在通風(fēng)柜中進(jìn)行)。
硝酸纖維素膜上的條帶不能脫去。
適用于中等靈敏度檢測各種印跡膜檢測，包括Southern雜交、Northern雜交、Western blot沉淀、免疫組化等。
三種顯色方法ECL、NBT/BCIP和DAB的對比:
1.ECL
增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光，一般含有魯米諾和H2O2、發(fā)光增強(qiáng)劑等物質(zhì)。發(fā)光試劑中的魯米諾被HRP和H2O2氧化，產(chǎn)生熒光，這個過程被發(fā)光增強(qiáng)劑加強(qiáng)。其中，增強(qiáng)劑在體系中扮演著核心角色，決定著ECL化學(xué)發(fā)光的發(fā)展。
理想的發(fā)光增強(qiáng)劑是：（1）發(fā)光靈敏，目前一般的發(fā)光增強(qiáng)劑都可以將發(fā)光靈敏度提高1000倍至100000倍以上；（2）發(fā)光穩(wěn)定，這是目前研究的重點(diǎn)之一，發(fā)光不穩(wěn)定的增強(qiáng)劑，容易在一些情況下發(fā)生“淬滅”，不容易被檢測到；（3）本底或背景低，這也是發(fā)展的方向之一，欲得到準(zhǔn)確可靠的結(jié)果，就必須確保試劑的特異性，在無HRP或很少HRP的情況下，不發(fā)光或很少發(fā)光。
2.NBT/BCIP:
是堿性磷酸酶最佳的底物組合之一。在堿性磷酸酶（AP）的催化下，BCIP會被水解而產(chǎn)生強(qiáng)反應(yīng)性產(chǎn)物，該產(chǎn)物與NBT發(fā)生反應(yīng)，形成不溶性的深藍(lán)色至藍(lán)紫色化學(xué)物。該試劑盒可用于堿性磷酸酶系統(tǒng)的IHC和WB實驗的酶促顯色。在AP的催化下，在組織切片或印跡膜上結(jié)合了AP偶聯(lián)物的地方產(chǎn)生深藍(lán)色沉淀，可根據(jù)顏色反應(yīng)來確定目的蛋白的位置及表達(dá)情況。
3.DAB:
二氨基聯(lián)苯胺（3，3’-diaminobenzidine，DAB）是過氧化物酶的顯色底物，在過氧化氫的存在下失去電子而呈現(xiàn)出顏色變化和積累，形成棕褐色不溶性產(chǎn)物，并就地原位沉淀。顯色反應(yīng)原理如下：
HRP＋H2O2+DAB→HRP＋H2O＋氧化型DAB↓
該方法特異性好，性能穩(wěn)定，操作便捷，適用于蛋白質(zhì)雜交和免疫化學(xué)，其終產(chǎn)物可直接在普通環(huán)境下觀察，但靈敏度是這三種方法中最低的，僅能達(dá)到500pg。
綜合如上所述，ECL和DAB都是HRP的底物，NBT/BCIP的酶是堿性磷酸酶。而且三者的顏色顯示不同，DAB的顯色是棕褐色，NBT/BCIP顯藍(lán)色，ECL顯熒光。在靈敏度方面，ECL化學(xué)發(fā)光的靈敏度最高，為1~5pg，也有達(dá)到fg級的，BCIP/NBT的靈敏度100pg，DAB的靈敏度最低，大約為500pg。在試驗中進(jìn)行選擇時，可根據(jù)不同的酶以及靈敏度等進(jìn)行選擇，并且注意操作時應(yīng)佩戴手套，避免將顯色劑與皮膚接觸，用后及時徹底沖洗。
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